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노화세포 및 β-galactosidase activity 검출용 형광 시약

■ 서론

GlycoGREEN™-βGal 은 동물세포의 cytoplasm 내 β-galactosidase 의 효소 활성을 측정하는 형광 시약 입니다. Green 파장대에서 관찰할 수 있습니다. (Excitation wavelength: 497 nm, Emission wavelength: 519 nm)

■ 제품 특징

  • 빠른 반응성과 높은 sensitivity
  • 배양 중인 세포 내의 β-galactosidase 활성 측정 (live cell imaging)
  • fixed cell staining 과 flow cytometry 분석에도 사용 가능

■ 측정 대상

  • 살아있는 세포 내 lacZ reporter gene 발현 정도를 측정
  • 노화 마커인 senescence cell의 SA-βGal 을 측정
  • 암세포의 β-galactosidase 발현 측정

■ 측정 메커니즘
GlycoGREEN™-βGal은 β-galactosidase 의 기질로 작용합니다. 반응 전에는 형광을 띄지 않지만 β-galactosidase 에 의해 분해되면 Green 계열의 형광을 나타내며 cytoplasm 내에서 부유하는 상태로 존재합니다. (Membrane에 흡착 X)

특징 1: live cell imaging 에 적합

GlycoGREEN™-βGal 은 권장 농도의 10배 높은 양을 처리하더라도 세포 성장에 영향을 주지 않을 만큼 낮은 toxicity를 나타냅니다. β-galactosidase 와 반응 후 즉시 매우 강한 형광을 나타냄으로써 live cell imaging 에 유리한 장점을 갖고 있습니다.

Figure 1. Suitability for live cell imaging.

LeftAn example of live cell imaging. LacZ expressing HEK293 cells (LacZ+) and normal HEK293 cells (LacZ–) are stained with 1 μM of GlycoGREEN™-βGal and another product S. Reagents were reacted at 37 ℃ for 15 minutes and observed under identical conditions.

RightToxicity against ovarian cancer derived OVCAR5 cells. Cell viabilities in the presence of 0, 0.1, 1, 10, 100 µM of GlycoGREEN™-βGal were determined using MTT assay kit. GlycoGREEN™-βGal was reacted at 37℃ in 5% CO2 condition for 24 hours.

특징 2: β-galactosidase 활성의 빠른 측정 및 높은 sensitivity

GlycoGREEN™-βGal 은 무반응 조건과 비교하여 β-galactosidase 효소반응 후에는 100 배 이상의 형광세기를 나타냅니다. 반응 실험 조건은 LacZ 발현 세포의 일반적인 조건 하에서 15 분간 반응시킨 후 이미지를 관찰하였습니다. ※ β-galactosidase 발현 정도에 따라 반응 시간이 추가로 필요할 수 있습니다.

Figure 2. In vitro reaction time course of GlycoGREEN™-βGal with β-galactosidase

β-galactosidase (final 5 units/mL) was added to 10 µM of GlycoGREEN™-βGal in phosphate buffer (pH 7.4, containing 0.1 % DMSO as a cosolvent). Fluorescence intensity change was measured using a microplate reader (TECAN infinite M200Pro) at 37℃. Excitation at 497 nm, emission, 519 nm.

특징 3: 세포 고정 후 염색(fixed cell staining) 및 유세포분석(flow cytometry)으로 실험 가능

세포 투과성을 갖는 GlycoGREEN™-βGal 은 세포 내 β-galactosidase을 측정할 수 있습니다. β-galactosidase과 반응 후, 세포 내 생성된 형광물질은 긴 시간 지속됩니다. 형광 시그널은 3% paraformaldehyde 로 15분 동안 fixation 한 뒤에도 줄어들지 않습니다. (Fig. 3)
또한GlycoGREEN™-βGal 은 flow cytometric analysis을 이용한 실험에도 사용이 가능합니다. (Fig. 4)

Figure 3. Fluorescence microscopy of fixed cells using GlycoGREEN™-βGal

left – Cells were fixed after the reaction with GlycoGREEN™-βGal (top) or other product S (bottom). After the reaction with 1 μM of reagents for 15 minutes, cells were fixed with 3% paraformaldehyde for 15 minutes.

right – Cells were fixed with 3% paraformaldehyde for 15 minutes and then, reacted with 1 μM of reagents for 15 minutes. Cells were rinsed before each observation. Cells were observed in a same condition.

Figure 4. An example of flow cytometric analyses

Flow cytometry results of unstained HEK293 (LacZ+), HEK293 (LacZ–) cells pre-reacted with 3 μM of AcidiFluor ORANGE (GC301) for 18 hours reacted with 1 μM of GlycoGREEN™-βGal for 1 hour, and HEK293 (LacZ+) cells reacted with 1 μM of GlycoGREEN™-βGal for 1 hour. Cells were washed with PBS and analyzed using FACSVerse (Becton Dickinson).

Figure 5. Fluorescence and absorption spectra of GlycoGREEN™-βGal

  • 10 µM GlycoGREEN™-βGal (pH 7.4 phosphate buffer, 0.1% DMSO) 과 β-galactosidase (5 units/mL)의 반응 시 형광 스펙트럼
  • • 반응 및 측정 조건 : 37℃, 30 minutes. (λex 497 nm)

참고문헌

Asanuma D, Sakabe M, Kamiya M, Yamamoto K, Hiratake J, Ogawa M, Kosaka N, Choyke PL, Nagano T, Kobayashi H, Urano Y (2015)
Sensitive β-galactosidase-targeting fluorescence probe for visualizing small peritoneal metastatic tumours in vivo.
Nature Communications, 6:6463. doi: 10.1038/ncomms7463.